厭氧菌在有氧的情況下不能生長。要培養厭氧菌，必須創造一個無氧的環境。通常用培養基中加入還原劑，或用物理、化學方法去除環境中的游離氧，以降低氧化還原電勢。如皰肉培養基、硫基乙酸鈉培養基，牛心腦浸液培養基等。
        常用的厭氧培養方法有許多，可根據實際情況選用。
        厭氧缸法 接種好標本的平板或液體培養基試管，可放入厭氧缸內培養，厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學的方法使缸內造成厭氧環境，從而將厭氧菌培養出來。
        厭氧袋（bio-bag） 即在塑料袋內造成厭氧環境來培養厭氧菌。塑料袋透明而不透氣，內裝氣體發生管（有BH2Na的碳酸氫鈉固體以及5%檸檬酸安瓿）、美蘭指示劑管、鈀催化劑管、干燥劑。放入已接種好的平板后，盡量擠出袋內空氣，然后密封袋口。先折斷氣體發生管，后折斷美蘭指示劑管，命名袋內在半小時內造成無氣環境。如不突變表示袋內已達厭氧狀態，可以孵育。

        厭氧手套箱（anaerobie glove box） 一個密閉的大型金屬箱，箱的前面有一個有機玻璃做的透明面板，板上裝有兩個手套，可通過手套在箱內進行操作，故名。箱側有一交換室，具有內外二門，內門通箱內先關著。欲放物入箱，先打開外門，放入交換室，關上外門進行抽氣和換氣（h2，co2，n2）達到厭氧狀態，然后手伸入手套把交換室內門打開，將物品移入箱內，關上內門。箱內保持厭氧狀態，也是利用充氣中的氫在鈀的催化下和箱中錢殘余氧化合成水的原理。該箱可調節溫度，本身是孵箱或孵箱即附在其內，還可放入解剖顯微鏡便于觀察厭氧菌菌落，這種厭氧箱適于作厭氧細菌的大量培養研究，大量培養基可放入作預還原和厭氧性無菌試驗。金屬硬壁型厭氧箱的抽氣、充氣、厭氧環境和溫度等均系自動調節。

        關于厭氧菌的分離培養方法及注意事項。
        （1）培養基的使用，應注意下列各點：
1）盡量使用新鮮培養基，2～4h內用完；
2）應使用預還原培養基，預還原24～48h更好；
3）可采用預還原滅菌法制作的培養基（用前于培養基中加入還原劑，如L-半胱氨酸、硫乙醇酸鈉、維生素C及葡萄糖等，盡可能使預還原劑處于還原狀態）；
4）液體培養基應煮沸10min，以驅除溶解氧，并迅速冷卻，立即接種醫。學教育網搜集整理；
5）培養厭氧菌的培養基均應營養豐富，并加有還原劑與生長過激因子（血清、維生素K、氯化血紅素、聚山梨酯-80等）。
        （2）培養基的選擇：初次培養一般都使用選擇培養基和非選擇培養基。
1）非選擇培養基：本培養基使分離的厭氧菌不被抑制，幾乎能培養出所有的厭氧菌。常使用心腦浸液瓊脂（BHI）、布氏瓊脂（BR）、胰豆胨肝粉瓊脂（GAM）、胰胨酵母瓊脂（EG）、CDC厭氧血瓊脂等。
2）選擇培養基：為有目的選擇常見厭氧菌株，以便盡快確定厭氧的種類。