在細(xì)胞培養(yǎng)的過程中，經(jīng)常會出現(xiàn)各種各樣的問題。為了大家能夠更好的進行細(xì)胞培養(yǎng)，本文對實驗中常出現(xiàn)的問題進行了匯總，方便大家查詢和學(xué)習(xí)。
問題1：血清中可能出現(xiàn)的沉淀物是什么？
基于多年的實驗研究，用于細(xì)胞培養(yǎng)的胎牛血清以及其它血清中可能會存在以下種類的沉淀物：
1、纖維蛋白，它是經(jīng)常出現(xiàn)的較大的沉淀物，可以達到1-2mm，可以用肉眼觀察到。因為血清都是在低溫下進行收集和快速處理的，一些纖維蛋白原（可溶性的形成絮狀纖維蛋白的前體）在處理過程中仍然處于溶解狀態(tài)，當(dāng)經(jīng)過MAX后的過濾分裝后，就會在瓶中凝結(jié)出現(xiàn)纖維蛋白沉淀。
2、磷酸鈣，它也是常見的一種沉淀物，通常會使血清出現(xiàn)渾濁，并且在37℃培養(yǎng)的時候會增加。這種沉淀物在倒置顯微鏡下觀察像小黑點，這些小黑點由于布朗運動看上去可以活動，因此經(jīng)常被誤認(rèn)為是微生物污染。
3、膽固醇、脂肪酸酯以及一些蛋白質(zhì)。他們也是血清中出現(xiàn)沉淀物的常見原因。
問題2：血清中的沉淀物對細(xì)胞培養(yǎng)有什么影響？
1、細(xì)胞生長，我們的試驗以及經(jīng)驗表明沉淀物不會影響細(xì)胞培養(yǎng)，我們的客戶以及其它血清生產(chǎn)商也證明了這一點。
2、過濾，如果血清中出現(xiàn)大量的沉淀物，血清將很難過濾。一般說來，因為在血清生產(chǎn)時MAX后已經(jīng)經(jīng)過100nm或者40nm的過濾處理，并且經(jīng)過了嚴(yán)格的無菌檢測，因此不推薦再過濾用于細(xì)胞培養(yǎng)的血清。在實驗室中沒有必要再過濾處理血清，以免操作不規(guī)范導(dǎo)致污染的發(fā)生。
3、污染，磷酸鈣往往被誤認(rèn)為微生物污染而引起爭端。研究者可能會在血清中觀察到一些絮狀的沉淀，因此就會比較警覺的去做無菌試驗，將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)幾天，結(jié)果可能會觀察到更多的絮狀沉淀，因此就斷定血清被污染了。并且當(dāng)研究者將血清樣品放在倒置顯微鏡下觀察時往往可以看到一些可以運動的小黑點，因此就更加確認(rèn)是血清被污染了。于是，研究者就會花費更多的時間和精力來和生產(chǎn)商確認(rèn)，但MAX終確定血清沒有被污染而只是沉淀。為了避免這些問題的發(fā)生，我們建議不要直接將血清放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察是否有菌，而是將血清加到瓊脂板上進行培養(yǎng)以觀察是否有細(xì)菌生長。另外，也可以進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察，以確認(rèn)是否有污染。
問題3：如何避免血清中沉淀物的出現(xiàn)？
首先要注意正確的血清解凍步驟，而且溶解過程中一定要每隔一段時間均勻而緩慢的搖動血清。我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在下列情況下沉淀物可能增加，使用中應(yīng)該盡量避免：
1、熱滅活血清；
2、使用電熱恒溫培養(yǎng)箱在37℃下培養(yǎng)血清；
3、反復(fù)凍融；
4、γ射線照射；
5、長期儲存在2-8℃；
6、在室溫下放置時間過長
問題4：如何去除血清中的沉淀？
如果想去除這些絮狀沉淀物，可以將血清分裝到無菌離心管中，以400g離心1~2min，上清液即可直接加入到培養(yǎng)基內(nèi)使用。
注意：不要以過濾的方式去除這些絮狀沉淀物，因為這可能阻塞濾膜。
問題5：凍存管應(yīng)如何解凍？
取出凍存管后，須立即放入37°C水槽中快速解凍，輕搖凍存管使其在1分鐘內(nèi)全部融化，并注意水面不可超過凍存管蓋沿，否則易發(fā)生污染情形。另凍存管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預(yù)防凍存管發(fā)生爆裂。
問題6：細(xì)胞凍存管解凍培養(yǎng)時，是否應(yīng)馬上去除DMSO？
除少數(shù)特別注明對DMSO敏感的細(xì)胞外，絕大部分細(xì)胞株（包括懸浮細(xì)胞），在解凍后，都應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO即可，如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無法生長或貼附的問題。
問題7：一般在拿到細(xì)胞后，應(yīng)該注意什么？
收到細(xì)胞后先不要開蓋，放在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)靜置若干小時后（看細(xì)胞密度而定）在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進行不同倍數(shù)拍照（建議對收細(xì)胞時的培養(yǎng)基拍一張照片，觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況，顯微鏡下拍細(xì)胞100X，200X各一張），排除細(xì)胞本身污染的情況；收到細(xì)胞未開封，出現(xiàn)污染狀況一般可以再申請免費發(fā)送一株細(xì)胞。
收到細(xì)胞時如無異常情況，請在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度，如為貼壁細(xì)胞，未超過80%匯合度時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液吸出，留下10ml培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；超過80%匯合度時，請按細(xì)胞培養(yǎng)條件傳代培養(yǎng)。如為懸浮細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液、1000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，吸出上清，管底細(xì)胞用新鮮培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞后移回培養(yǎng)瓶。
細(xì)胞消化液建議使用PBS配制，慎用Hanks液配制。
問題8：可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基？
一般不建議。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基，若驟然使用和原先提供的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基，細(xì)胞大都無法立即適應(yīng)，造成細(xì)胞無法存活。
問題9：可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類？
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源，所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。
問題10：L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有MAX終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成，而氨對于一些細(xì)胞具有毒性。
問題11：培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5%或10%CO2？或根本沒有影響？
一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng)，而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7g時，細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10%CO2；當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5g時，則應(yīng)使用5CO2培養(yǎng)細(xì)胞。
問題12：何時須更換培養(yǎng)基？
視細(xì)胞生長密度而定，或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間，按時更換培養(yǎng)基即可。
問題13：培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？
除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。
如果是沒有進行過細(xì)胞培養(yǎng)的新手，對無菌技術(shù)沒有信心的，或者提取的原代細(xì)胞，怕污染的，可以適量添加抗生素。
抗生素本身也是有毒性的，有些抗生素的藥效濃度水平與毒效濃度水平非常接近，對細(xì)胞多少有傷害。
問題14：懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何傳代處理？
一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中，稀釋細(xì)胞濃度即可，若培養(yǎng)液太多時，可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶，加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度，重復(fù)前述步驟即可。
問題15：想將一般動物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？
回收動物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg(約1000rpm)，5-10分鐘，過高之轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。
問題16：細(xì)胞的接種密度為何？
依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長之一重要原因。
問題17：細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何？
動物細(xì)胞冷凍保存時MAX常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和90-95%原來細(xì)胞生長用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。
問題18：冷凍保存細(xì)胞的方法？
冷凍保存方法一:冷凍管置于4°C30-0分鐘→(-20°C30分鐘*)→-80°C16~18小時(或隔夜)→液氮槽vaporphase長期儲存。冷凍保存方法二:冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3°C至–80°C以下，再放入液氮槽vaporphase長期儲存。-20°C不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C冰箱中，惟存活率稍微降低一些。
問題19：細(xì)胞要冷凍保存時，細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106cells/mlvial，融合瘤細(xì)胞則以5x106cells/mlvial為宜。
問題20：應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？
細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒、原蟲、支原體。主要的污染原因為無菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染MAX適合的方法。
